Modelo 3D de esferoide de melanoma para el desarrollo de biomarcadores de positronio

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7648 (2023) Citar este artículo

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Recientemente se demostró que las imágenes de positronio recientemente inventadas pueden usarse para mejorar el diagnóstico del cáncer al proporcionar información adicional sobre la patología del tejido con respecto al valor de captación estandarizado actualmente disponible en la tomografía por emisión de positrones (PET). Las imágenes de positronio utilizan las propiedades de los átomos de positronio, que se construyen a partir de los electrones y positrones producidos en el cuerpo durante los exámenes PET. Presumimos que las imágenes de positronio serían sensibles a la discriminación in vitro de estructuras tridimensionales similares a tumores (esferoides) construidas a partir de líneas celulares de melanoma con diferentes actividades cancerosas y propiedades biológicas. Se evaluó el tiempo de vida del ortopositronio (o-Ps) en esferoides de melanoma de dos líneas celulares (WM266-4 y WM115) que diferían en el estadio de malignidad. Además, consideramos parámetros como el número de células, el tamaño del esferoide y la malignidad del melanoma para evaluar su relación con la vida útil de las o-P. Demostramos resultados piloto para la medición de la vida útil de o-Ps en esferoides sin matriz extracelular. Con la significancia estadística de dos desviaciones estándar, demostramos que cuanto mayor es el grado de malignidad y la tasa de proliferación de células neoplásicas, menor es la vida útil del ortopositronio. En particular, observamos las siguientes indicaciones que alientan la investigación adicional: (i) los esferoides WM266-4 caracterizados por una mayor tasa de proliferación y malignidad mostraron una vida útil más corta de o-Ps que los esferoides WM115 caracterizados por una tasa de crecimiento más baja. (ii) Ambas líneas celulares mostraron una disminución en el tiempo de vida de los o-P después de la generación de esferoides el día 8 en comparación con el día 4 en cultivo, y el tiempo de vida medio de los o-P fue más largo para los esferoides formados a partir de células WM115 que para los formados a partir de WM266. -4 células, independientemente de la edad del esferoide. Los resultados de este estudio revelaron que el positronio es un biomarcador prometedor que se puede aplicar en el diagnóstico de PET para la evaluación del grado de malignidad del cáncer.

En las últimas décadas, los cultivos celulares tridimensionales (3D) se han utilizado ampliamente como modelos in vitro, que pueden cerrar la brecha entre las condiciones celulares in vitro e in vivo1. La comparación del cultivo celular 3D con una monocapa celular reveló algunas características fisiológicas y morfológicas específicas, como interacciones célula a célula y célula-matriz, señalización celular, proliferación y necrosis. A diferencia de un cultivo de células monocapa, un esferoide 3D es un modelo apropiado para imitar el entorno de células tumorales reales y la tasa de difusión de nutrientes entre las células. Los esferoides tumorales multicelulares nos permiten estudiar el mecanismo bioquímico del crecimiento celular, las reacciones enzimáticas y diversas modalidades de tratamiento2,3,4,5.

El melanoma es un tipo frecuente de cáncer de piel que se ha categorizado como uno de los cánceres más letales. El melanoma, como el cáncer más letal, es una enfermedad multifactorial en la que tanto la susceptibilidad genética como la exposición ambiental, predominantemente a la luz ultravioleta, juegan un papel importante6. Los factores de riesgo ambientales designados para el cáncer de melanoma son la exposición a la radiación solar ultravioleta (UVB) y las quemaduras solares (UVA). La radiación UVB causa daños directos en el ADN, lo que conduce a roturas de la cadena de ADN. La UVB también promueve la supervivencia, la angiogénesis y la invasión de las células del melanoma debido al aumento de la penetración de macrófagos y neutrófilos en las células de la piel. Los rayos UVA causan daños en el ADN a través de la producción de radicales libres, que inducen estrés oxidativo en los melanocitos. El riesgo de melanoma también puede estar asociado con mutaciones hereditarias y mutaciones somáticas, pero la tendencia genética es responsable solo de una pequeña cantidad de casos. Dado que la eficacia del tratamiento del melanoma en estadios avanzados es baja, existe una necesidad constante de desarrollar nuevas terapias dirigidas, inmunoterapia y terapias combinadas7 (fig. 1).

Vista esquemática de los melanocitos y la formación de una lesión de melanoma en la capa epidérmica. (A) Los melanocitos normales tienen una forma dendrítica regular y forman muchos procesos ramificados que se extienden entre numerosos queratinocitos (izquierda). Un melanocito alcanza entre 36 y 40 queratinocitos, formando una unidad de melanina epidérmica (EMU), con una proporción equilibrada de un melanocito por cada uno de los 8-10 queratinocitos en la capa basal de la epidermis. En una lesión de melanoma (derecha), los melanocitos pierden su dendricidad y se vuelven malignos y de forma ameboidea, cambiando sus contactos célula-célula al expresar diferentes moléculas de adhesión (N-cadherina en lugar de E-cadherina expresada por los melanocitos)7. Los melanosomas almacenan los gránulos de melanina producidos por los melanocitos, que pueden distribuirse entre los queratinocitos circundantes para protegerlos del daño de la radiación UV. (B) Ilustraciones pictóricas de aniquilaciones de positrones en la molécula de melanina. Los átomos de carbono, oxígeno, hidrógeno, nitrógeno, p-Ps y o-Ps se indican en colores explicados en la leyenda. Las flechas discontinuas indican fotones de la aniquilación directa electrón-positrón. Las flechas rojas indican fotones de la autoaniquilación de átomos de o-Ps. Las flechas azules muestran los fotones de la autoaniquilación de p-Ps. Las flechas verde y marrón indican el decaimiento de o-Ps a través de los procesos de selección y conversión, respectivamente.

Aunque se han dedicado numerosos estudios a diagnosticar el melanoma en las primeras etapas, se necesita más investigación y seguimiento. La tasa de metástasis en pacientes por melanoma es alta, con 350.000 casos nuevos por año, y el número de casos nuevos aumenta significativamente cada año8,9,10.

En este estudio, se evaluó un modelo esferoide 3D de dos líneas celulares de melanoma, WM266-4 y WM115, con diferentes etapas de malignidad. Las líneas celulares de melanoma WM266-4 y WM115 tienen varias propiedades biológicas que las hacen diferentes en cuanto a proliferación, velocidad de migración y tamaño celular. La activación de productos finales de glicación avanzada (AGE), que se producen durante la combinación de lípidos y proteínas con azúcar en el metabolismo humano, y proteínas como el receptor para AGE (RAGE) y las quinasas N-terminales c-Jun (JNK) en la línea WM266-4 hace que esta línea celular sea más invasiva que la línea WM11511. Además, la expresión del gen SLC7A5 (variante de Large Amino-acid Transporter 1) en WM115 es mayor que en WM266-4, en contraste con la expresión del gen SLC7A8, que es menor en WM115 que en WM266-412. Estos genes están involucrados en la importación de aminoácidos y son esenciales para la pigmentación celular, y la línea celular WM115 es más oscura que la línea celular WM266-4.

En este estudio, planteamos la hipótesis de que la diferencia entre el grado de malignidad de los cánceres de melanoma WM115 y WM266-4 presentes en el nivel de la fisiología celular puede probarse mediante biomarcadores de positronio. Un positronio es un átomo exótico formado por positrones y electrones13. El positronio también se forma en los espacios intramoleculares durante el diagnóstico PET13. En el tejido, el positronio puede formarse y quedar atrapado en los vacíos libres de los espacios intramoleculares, como se muestra gráficamente en la Fig. 114. El positrón emitido por el radionúclido (p. ej., 18F en el diagnóstico por PET o 22Na en el diagnóstico típico de aniquilación de positrones). experimentos de espectroscopia (PALS)) penetra en el objeto y, después de perder la energía, aniquila con un electrón las moléculas que constituyen las células. La aniquilación electrón-positrón en fotones puede ocurrir directamente (e + e− → fotones (flechas negras discontinuas en la Fig. 1B)) o a través de un átomo de positronio [e + e− → positronio → fotones (flechas sólidas en la Fig. 1B)]. En una cuarta parte de los casos, el positronio se forma como un estado de vida corta (125 ps) llamado para-positronio (p-Ps), y en las tres cuartas partes de los casos, se forma como un estado de vida larga (142 ns). ) orto-positronio (o-Ps). El parapositronio (indicado en azul en la Fig. 1B) se desintegra predominantemente en dos fotones (flechas azules), y el ortopositronio se desintegra en el vacío predominantemente en tres fotones (flechas rojas). Sin embargo, en los vacíos intramoleculares, el ortopositronio sufre procesos como el desprendimiento (el positrón de o-Ps se aniquila en dos fotones (flechas verdes) con un electrón de la molécula circundante) y la conversión en parapositronio a través de la interacción con las moléculas. como las moléculas de oxígeno. El parapositronio resultante se desintegra en dos fotones (flechas marrones). El rango de variación de la vida útil media de o-Ps es significativo y cambia de 142 ns en vacío a 1,8 ns en agua15,16. Por lo tanto, la vida útil del ortopositronio depende en gran medida del entorno molecular: la estructura nanomolecular y la concentración de las moléculas bioactivas13,14,15,16,17,18,19. Las propiedades del positronio en muestras biológicas han sido escasamente estudiadas hasta el momento. Solo recientemente se realizaron los primeros estudios de positronio en estructuras celulares 3D mediante el cultivo de células en andamios de colágeno20. Otros estudios sobre células de cáncer de piel (carcinomas de células basales y escamosas) se realizaron utilizando un haz de positrones de baja energía que limitaba la penetración en la piel21,22,23.

La primera investigación in vitro sobre el tiempo de vida del positronio en tejidos de pacientes indicó resultados prometedores en vista de la aplicación del positronio como biomarcador para el diagnóstico de cáncer de útero y cáncer de mixoma y como biomarcador de hipoxia24,25,26,27. Recientemente, se propuso el positronio como un biomarcador novedoso para la evaluación in vivo de la patología tisular13,25 que se puede visualizar usando un método de imagen de positronio recientemente desarrollado15,19,26,28 cuando se aplican radionúclidos de fotones rápidos28,29,30,31 y alta escáneres PET de sensibilidad28. Además, la llegada de los sistemas PET de cuerpo entero caracterizados por una alta sensibilidad32,33,34,35 permitirá la aplicación simultánea de imágenes con positronio a las imágenes metabólicas estándar durante la tomografía por emisión de positrones29,36,37.

El objetivo de este estudio fue determinar si las imágenes de positronio serían sensibles a la discriminación in vitro de estructuras tridimensionales similares a tumores (esferoides) construidas a partir de líneas celulares de melanoma con diferentes actividades cancerosas y propiedades biológicas.

Dos líneas celulares de melanoma, WM266-4, una línea celular de cáncer de melanoma maligno humano, y WM115, una línea celular de un melanoma primario, se compraron en ESTDAB Melanoma Cell Bank (Tübingen, Alemania) y se cultivaron como describimos previamente38. Se usó un contador de células automatizado Luna-II™ (Logos Biosystems, Inc.) para determinar los recuentos de células y la viabilidad antes de la siembra celular.

Ambas líneas celulares, WM266-4 y WM115, se sembraron en placas esféricas 5D (5D sp5dplate, Kugelmeiers, Suiza) para formar esferoides39. La microplaca 5D tiene 24 pocillos, 12 pocillos con superficie nanocoated para la formación de esferoides y 12 pocillos como control. En nuestro estudio no se utilizaron pocillos de control. Cada pozo contiene 750 microcavidades (con 509 μm de diámetro y 320 μm de profundidad) que están separadas entre sí por bordes afilados, y estos bordes evitan la migración celular de una microcavidad a otra; por lo tanto, se pueden cultivar 9000 esferoides con formas y diámetros uniformes en una sola placa.

Para la siembra de células, se añadieron 0,5 ml de medio completo a cada pocillo. A continuación, se añadió a cada pocillo de la placa 0,5 ml de medio extra que incluía 1.125.000 células/pocillo (1500 células/micropocillo). Las células en el tubo Falcon se resuspendieron para distribuirlas en todo el medio y luego se agregaron a los pocillos.

Después de la siembra de células, las placas se mantuvieron en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 con humedad. El medio de cultivo celular se renovó todos los días después de que se formaron los esferoides. Se eligieron dos puntos de tiempo adecuados de crecimiento de esferoides para medir el tiempo de vida medio de o-Ps. La morfología del esferoide y la tasa de proliferación también se determinaron bajo un microscopio óptico (Olympus, IX-LWPO, T2, Japón) los días 4 y 8 después de la siembra celular. El análisis de imágenes se realizó con el software ImageJ.

En primer lugar, los esferoides se disociaron en una suspensión unicelular con tripsina/EDTA (Gibco, nº de cat. 25200072, Waltham, MA, EE. UU.). Luego, se incubaron 100 µl de esferoides de tripsina/EDTA durante 10–20 min a 37 °C y se pipetearon varias veces para separar las células. Luego, las células se centrifugaron a 300 g durante 3 min, se eliminó el sobrenadante y se agregaron 100 µl de medio (Gibco, cat. no. 10010056, Waltham, MA, EE. UU.) a las células y se pipeteó varias veces para separar las células. completamente. En el paso final, se añadieron 10 µl de células a 10 µl de azul de tripán y se contaron (el contador de células Luna-II™, Logos Biosystems, Aligned Genetics, Inc). El flujo de trabajo se muestra en la Fig. 2. Cada prueba de viabilidad se realizó en 4 muestras diferentes en cada medición bajo las mismas condiciones.

Flujo de trabajo para la investigación de la viabilidad de esferoides después de recolectar esferoides 3D de microplacas 5D.

Después de 15 min en la incubadora, se revisaron las células para asegurarse de que no hubiera agregados. Después de la prueba de viabilidad utilizando el contador de células, se evaluó el mapa de conglomerados de células para determinar el porcentaje de conglomerados. En nuestros experimentos, los mapas de conglomerados mostraron un alto porcentaje de disociación, por encima del 90%. Posteriormente, el tamaño de las células para ambas líneas celulares en forma 3D se verificó mediante investigaciones microscópicas y de contador de células. Para la estimación del tamaño de la celda,

Se utilizó un contador de células Luna II™. Con respecto al histograma de distribución de tamaños, se estimó el diámetro medio de las células. A modo de comparación, también se determinó el tamaño de las células en cultivos 2D. Para ello, se extrajeron los esferoides de cada pocillo utilizando una pipeta de 3 ml de gran calibre para evitar la destrucción de la estructura del esferoide. Luego, los esferoides se vertieron en un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugaron a 500 g durante 7 min. En el siguiente paso, se eliminó el sobrenadante y se agregó 1 ml de medio fresco a los esferoides.

Para evaluar la captación de glucosa, una sonda de d-glucosa que emite fluorescencia 2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-2-desoxiglucosa) (Thermo Fisher Scientific, nº de catálogo N13195). Para evaluar la distribución de la tasa de consumo de oxígeno en los esferoides, se sembraron células WM266-4 y WM115 a densidades de 1000 y 2000 células/gota. Los días 4 y 8, los esferoides se transfirieron a platos con fondo de vidrio y se agregaron 20 μl de 2-NBDG (200 μM) a cada esferoide. Los esferoides se incubaron a 37 °C durante 45 min. Finalmente, los esferoides se lavaron con PBS y las imágenes de esferoides se tomaron con un microscopio Nikon Eclipse Ti-E acoplado a un sistema confocal de exploración A1 (Nikon, Japón) a una longitud de onda fluorescente de 494 nm/551 nm.

La distribución de la tasa de consumo de oxígeno se determinó utilizando un kit de hipoxia, Image-IT™ Green Hypoxia Reagent (Thermo Fisher Scientific, nº de cat. I14834). Para evaluar la distribución de la tasa de consumo de oxígeno en los esferoides, se sembraron células WM266-4 y WM115 a densidades de 1000 y 2000 células/gota. Los días 4 y 8, los esferoides se transfirieron a platos con fondo de vidrio y se agregaron 20 μl de reactivo de hipoxia Image-IT™ (10 μM) a cada esferoide. Los esferoides se incubaron a 37 °C durante 1 hora. El tinte de hipoxia se intercambió con medio de crecimiento fresco y los esferoides se colocaron nuevamente en una incubadora de cultivo celular durante las siguientes 4 h. Las imágenes de esferoides se tomaron con un microscopio Nikon Eclipse Ti-E acoplado a un sistema confocal de exploración A1 (Nikon, Japón) a una longitud de onda fluorescente de 488 nm/520 nm.

Para obtener resultados fiables y precisos de la vida útil del positronio en esferoides, utilizamos esferoides sin ningún medio, sobrenadante o compuestos químicos. En este método, los esferoides recolectados de las microplacas se prepararon para medir la vida útil del positronio después de la centrifugación y la eliminación completa del medio de los esferoides.

La vida útil del positronio se midió utilizando un espectrómetro que consta de dos centelleadores de plástico BaF2 dispuestos verticalmente (SCIONIX, Holanda) y dos fotomultiplicadores con números de serie SBO696 y SBO697 (Hamamatsu, Japón) alimentados por una fuente de alimentación de alto voltaje (CAEN SY4527). Las señales de los fotomultiplicadores fueron leídas y analizadas por el osciloscopio analizador de datos 6000A (Le Croy). Los esferoides fueron irradiados por positrones emitidos por el radionúclido 22Na (con una actividad de aproximadamente 1 MBq) colocado en una lámina de Kapton. Se usó una cámara de aluminio dedicada como contenedor para esferoides y se conectó un soporte a un calentador para mantener las celdas a 37 °C. La configuración de medición se muestra pictóricamente en la Fig. 3.

Los esferoides que rodean la fuente de 22Na están ubicados en la cámara dedicada entre dos detectores de BaF2. Los esferoides están adyacentes a la fuente de 22Na y no hay espacio ni burbuja entre ellos. Para cada medición, se recolectaron 106 eventos con el registro coincidente de fotones de 511 keV y fotones de 1274 keV.

El radionúclido 22Na después de la emisión del positrón se transforma al estado excitado del isótopo 22Ne que se desexcita (en promedio después de 2,6 ps) mediante la emisión del cuanto gamma de 1274 keV29,30. El positrón pierde energía al pasar a través de las células y finalmente se aniquila con el electrón en dos cuantos gamma de 511 keV consecutivos. La aniquilación de positrones y electrones puede proceder directamente o mediante la creación del positronio. El tiempo entre la emisión del positrón y su aniquilación se mide por el registro del fotón de desexcitación de 1274 keV y uno de los fotones de aniquilación de 511 keV. La muestra con la fuente se coloca de una manera (ver Fig. 3) que permite el registro coincidente de gamma de 1274 keV y un fotón de 511 keV, y evita el registro coincidente de ambos fotones de 511 keV volando uno tras otro. En la Fig. 4 se muestra un espectro de vida útil ejemplar determinado como resultado de la medición.

Ejemplo de espectro de vida útil de positronio. Datos experimentales (histograma negro) con histogramas superpuestos resultantes del ajuste de la suma de la función exponencial convolucionada con la resolución del detector, realizado mediante el programa PALS Avalanche25,40. El primer componente (línea amarilla) muestra la contribución de p-Ps (vida media: 0,125 ns), el segundo componente (línea verde) se origina en aniquilaciones en la fuente (lámina Kapton) (0,374 ns), el tercer componente (azul claro ) muestra el tiempo de vida de aniquilación libre (0.395 ns), y el cuarto componente (azul oscuro) ilustra la contribución de o-Ps. La suma de todas las contribuciones resultantes del ajuste se muestra como una curva roja.

Antes de cada medición, el sistema se calibró utilizando una cámara vacía que incluía solo la fuente de 22Na. Para realizar la medición, se transfirieron esferoides desde el tubo de centrífuga a la cámara utilizando un escalpedor y se colocaron fuentes radiactivas de 22Na entre las muestras. Luego, la muestra de esferoide se colocó junto a la fuente, sin aire entre la fuente y los esferoides. Luego, la cámara se colocó dentro de un soporte que se conectó a un calentador para mantener las celdas a 37 °C. Finalmente, el soporte se ubicó entre dos detectores de BaF2, como se indica en la Fig. 3.

Se evaluó la vida útil del positronio en esferoides en dos puntos de tiempo diferentes, el cuarto y el octavo día después de sembrar las células, en base a los 106 eventos recopilados para cada caso estudiado. En este estudio, solo se evaluaron esferoides sin medio, agua y ningún producto químico.

El tiempo de vida del positronio se extrajo de cada espectro registrado ajustando la suma de cuatro funciones exponenciales convolucionadas con la función de resolución del detector40,41. El espectro ejemplar con el resultado del ajuste se muestra en la Fig. 4. Los componentes ajustados corresponden a la desintegración del parapositronio (curva amarilla), la aniquilación directa en la lámina fuente/Kapton (curva verde) y la aniquilación de orto- positronio (azul oscuro). El experimento completo se repitió tres veces.

Los esferoides ejemplares cultivados en la microplaca se muestran en la Fig. 5. La línea celular WM266-4 formó esferoides más esféricos y concentrados que la línea celular WM115, como se informó previamente38. Los esferoides en ambas líneas celulares mostraron un aumento en su tamaño y circularidad con el tiempo. En general, la tasa de crecimiento y el tamaño de los esferoides dependen del tamaño de las cavidades y del tipo de placas que se hayan sembrado. Cuanto más grandes son las microcavidades, más grandes son los esferoides formados⁠. Aunque el tamaño de los esferoides se puede controlar mediante la siembra del cultivo inicial, las escalas de los micropocillos también pueden afectar el diámetro del esferoide42.

Comparación de esferoides de diferentes líneas celulares de melanoma. (A) Imágenes microscópicas de dos líneas celulares diferentes, WM266-4 y WM115, en los días 4 y 8 de cultivo. La densidad y circularidad de los esferoides aumentó durante el tiempo de cultivo. (B) En función del tiempo de cultivo, los esferoides WM266-4 mostraron un volumen mayor que los esferoides WM115. (C) El número de células en la placa aumentó durante el tiempo de cultivo para ambas líneas celulares. El número de células en una placa se calculó usando el contador de células Luna II después de la recolección de esferoides.

La Figura 5B,C muestra que los esferoides WM266-4 y WM115 crecieron con el tiempo. Los esferoides WM266-4 exhibieron una tasa de proliferación más rápida que los esferoides WM115, que volvieron a sus características malignas.

La figura 5B muestra que hubo un aumento en el número de células desde la siembra de células hasta el octavo día después del cultivo. La tasa de división de las células WM266-4 en esferoides fue mayor que la de las células WM115. WM266-4 dio como resultado aumentos de 1,5 y 2,74 veces en el número de células después de 4 y 8 días, respectivamente. El número de células en los esferoides WM115 aumentó 1,4 y 1,7 veces después de 4 y 8 días, respectivamente. Se utilizaron un total de 36.000 esferoides en cada medición de vida útil de positronio.

Los esferoides WM266-4 comprendían células con un diámetro de 15,70 ± 0,10 μm el día 4 después de la siembra de células y 15,92 ± 0,08 μm el día 8, mientras que el diámetro de la célula esferoide WM155 era igual a 16,66 ± 0,20 μm el día 4 y 17,28 ± 0,25 μm el día 8. El tamaño medio de las células teñidas en cultivo celular 2D fue más pequeño que el tamaño de las células de los esferoides 3D, 14,65 ± 0,09 μm y 16,27 ± 0,10 μm para WM266-4 y WM115, respectivamente.

El número de células en ambas líneas celulares aumentó con el tiempo. El crecimiento observado fue más rápido para la línea celular WM266-4 que para la línea celular WM115. WM115 tiene un tiempo de duplicación más largo que WM266-4, aproximadamente 7,5 y 6 días, respectivamente, lo que significa que las células de la línea WM115 pasan más tiempo en su ciclo celular que las células de la línea WM266-4. El tiempo de duplicación (DT) de los esferoides generalmente se caracteriza como el tiempo de duplicación real del tumor y se calcula utilizando el volumen del esferoide a través de:

donde V1 y V2 son volúmenes esferoides en los tiempos t1 y t2 = t1 + t después de la siembra, respectivamente43,44,45.

De acuerdo con el análisis de intensidad de fluorescencia (Fig. 6), la región entre 100 y 200 µm del centro de un esferoide se consideró la capa externa, también llamada borde de proliferación, y la región entre 50 y 100 µm de la parte interna de el esferoide fue considerado como un núcleo necrótico. Sin embargo, el tamaño de las diferentes capas de un esferoide depende del tamaño del esferoide. La intensidad de la fluorescencia después de 4 días en esferoides obtenidos a partir de un número inicial de 1000 células en el borde de los esferoides WM266-4 no fue significativamente mayor que la de WM115 (p = 0,20), mientras que en la región más profunda de los esferoides, una mayor intensidad de se observó captación de glucosa en los esferoides WM266-4 que en los esferoides WM115 (p = 0,00001). Los esferoides más grandes formados a partir de 2000 células mostraron una mayor captación de glucosa después de 4 días, y la intensidad fue significativamente mayor en el borde de proliferación (p = 0,04) y en el área central en esferoides WM266-4 frente a esferoides WM115 (p = 0,0018). El día 8, los esferoides WM266-4 y WM115 mostraron una diferencia significativa en la intensidad de la captación de glucosa en el borde de proliferación (p = 0,007) pero no en el núcleo (p = 0,064) (Fig. 6).

Determinación de la distribución de glucosa en esferoides de melanoma. La concentración de glucosa se observa igualmente distribuida en el borde de proliferación en esferoides WM266-4 (A) y líneas celulares WM115 más dispersas (B) con diferencias significativas en los esferoides más grandes y antiguos. Gráfico de distribución de glucosa en esferoides WM266-4 (C) y WM115 (D) en dos puntos de tiempo de cultivo diferentes evaluados con la sonda 2-NBDG.

En el día 4 de cultivo, la progresión de la hipoxia medida como intensidad de fluorescencia en esferoides con un número de células inicial de 1000 no fue significativamente diferente (p > 0,05), mientras que en el día 8, el grado de hipoxia en el centro de los esferoides WM266-4 fue significativamente mayor que la de los esferoides WM115 (p = 0,0001). En los esferoides más grandes durante el cultivo, el grado de hipoxia en los esferoides WM266-4 fue significativamente mayor (p < 0,001) que en los esferoides WM115, mientras que en el día 8, los esferoides WM266-4 y WM115 mostraron una diferencia significativa en la progresión de la hipoxia. en su centro (p = 0,00048) pero no en la parte exterior (p = 0,24) (fig. 7).

Determinación de la progresión de la hipoxia en esferoides de melanoma. La región hipóxica se observa en el centro de los esferoides en (A) líneas celulares WM266-4 y (B) WM115 con diferencias significativas en los esferoides más grandes y antiguos. Gráfico de distribución de hipoxia en esferoides WM266-4 (C) y WM115 (D) en dos momentos de cultivo diferentes evaluados con la sonda Image-IT™ Green Hypoxia.

La vida media de los átomos de ortopositronio en los esferoides se estableció para dos líneas celulares diferentes caracterizadas por diferentes grados de malignidad: WM115 y WM266-4. Ambas mediciones se realizaron para esferoides en dos momentos diferentes: en los días 4 y 8 después de la siembra. Las pruebas de viabilidad se evaluaron antes y después de cada medición de PALS y mostraron que la viabilidad de los esferoides se mantuvo constante por encima del 85 % hasta el octavo día. Por lo tanto, los esferoides estuvieron en buenas condiciones y estables durante el experimento.

La medición del tiempo de vida del positronio se repitió tres veces. En cada medición, se recolectaron esferoides de la placa y se colocaron dentro de la cámara.

La Figura 8 demuestra los resultados del tiempo de vida medio de o-Ps y la distribución en esferoides de melanoma 3D con diferentes niveles de malignidad en dos edades diferentes.

Comparación de la vida media y la intensidad de o-Ps para diferentes líneas celulares de melanoma. (Izquierda) La vida útil de o-Ps en esferoides WM266-4 (cuadrados negros) y WM115 (puntos rojos) en dos edades diferentes, 4 y 8 días después de la siembra celular. (Derecha) Intensidad de producción de o-Ps en esferoides WM266-4 (cuadrados negros) y esferoides WM115 (puntos rojos) en función del tiempo. Para comparar los o-P medios en relación con el metabolismo de los esferoides, consulte el archivo complementario 1.

Los resultados obtenidos que se muestran en la Tabla 1 muestran que los esferoides WM266-4 con más malignidad, tasa de proliferación y alta concentración de células en esferoides tienen una vida media de ortopositronio más corta que las células WM115, por lo tanto, vacíos intermoleculares libres más pequeños que las células WM115 de el tumor primario con menor tasa de división y menor concentración de células a lo largo del tiempo. Aunque ambas líneas celulares muestran una disminución gradual en la vida útil de las o-P durante el tiempo de cultivo, las o-P muestran una vida útil más prolongada en los esferoides WM115 que en los WM266-4. La intensidad en los esferoides WM266-4 se mantuvo casi constante mientras que los esferoides WM115 presentan una disminución en la intensidad de < 3SD >, lo que puede considerarse como cambios a nivel molecular en las células de los esferoides WM115.

Recientemente, se introdujeron las imágenes de positronio14,15,19,46 y se demostraron las primeras imágenes de positronio in vitro25,26, lo que abrió nuevas posibilidades para mejorar el diagnóstico del cáncer mediante el uso de positronio como biomarcador de patología tisular13,14.

El objetivo principal de este estudio fue probar la hipótesis de que el positronio puede servir como un nuevo biomarcador para evaluar las diferentes actividades del cáncer y las propiedades biológicas en las células cancerosas y realizar los primeros estudios de las propiedades del positronio en esferoides de células 3D. Para probar esta hipótesis, se utilizaron esferoides 3D porque pueden imitar la estructura de tumores reales en condiciones fisiológicas. La morfología y las interacciones célula-célula en los esferoides 3D son completamente diferentes a las del cultivo celular en monocapa. Además, tienen ciertas ventajas sobre los métodos de investigación estándar, incluido el bajo costo de uso, alta reproducibilidad, ahorro de tiempo y menor necesidad de modelos animales de laboratorio. Las propiedades únicas de los esferoides tumorales 3D los hacen invaluables para experimentos biológicos y pruebas de drogas en una variedad de estudios experimentales enfocados en quimioterapia y radioterapia1,2,3,4,5,47,48.

El tiempo del ciclo celular en células 2D y esferoides 3D es significativamente diferente porque las células en cultivo celular monocapa tienen condiciones biológicas homogéneas; en una monocapa confluente, la mayoría de las células se encuentran en el mismo ciclo celular y tienen suficiente accesibilidad a los nutrientes y al oxígeno. En el cultivo celular 3D con una estructura multicapa, las células se encuentran en diferentes ciclos celulares y la accesibilidad a los nutrientes necesarios para la supervivencia depende de su distancia a la superficie49. Durante el ciclo celular, las células en la fase G1 crecen hasta el final de la fase G2 cuando comienzan la mitosis y la división después de pasar los puntos de control. En los esferoides, el espacio para la proliferación es limitado y se forma un núcleo necrótico rodeado por una capa inactiva donde las células se detienen en la fase G1 del ciclo y un borde proliferante en la parte más externa de los esferoides donde las células pueden permanecer en la S /G2/M fase50. En nuestro estudio se observó una diferencia significativa en la dinámica de formación de esferoides y proliferación celular. Observamos que la línea celular más maligna (WM266-4) formó esferoides más grandes (ambos en los días 4 y 8 en cultivo) con una mayor cantidad de células (Fig. 5B, C), y el diámetro celular en los esferoides fue menor que que en la línea celular de melanoma primario (WM115).

La investigación anterior sobre la vida útil del positronio se ha realizado principalmente en diferentes tipos de tejidos y cultivos de células monocapa, como células de cáncer de piel y cáncer colorrectal20,21,22,23,46,51,52. En esta nueva investigación, la vida útil del positronio se evaluó en esferoides 3D en lugar de cultivo celular o tejido 2D. Aunque se ha realizado mucha investigación sobre el positronio en materiales y muestras biológicas, la investigación que usa agregados de células 3D se limita a la determinación de la vida útil de o-Ps en agregados de células de cáncer colorrectal 3D con una mezcla de células y colágeno20. Se demostró que el tiempo de vida medio de o-Ps es un indicador sensible del volumen vacío medio en cultivos de cáncer 3D estimulados con el factor de crecimiento que afecta a la estimulación de células epiteliales (TGF-β). Las colonias tratadas con TGF-β mostraron un crecimiento con la media de o-Ps 2-3 semanas después de la estimulación, que disminuyó al valor en condiciones de control en la fase tardía del cultivo19. Esta distribución de o-Ps indicó una posible relación entre la dinámica celular y los vacíos moleculares medios. El comportamiento de difusión de moléculas pequeñas (Å) se ha investigado utilizando PALS en diferentes muestras biológicas (pelo, plumas, algodón y seda), demostrando que las o-P son sensibles a la investigación de vacíos en polímeros biológicos53,54. La vida útil de los o-P en la célula puede ser diferente de la vida útil medida en el caso de que la célula esté en un medio que contenga agua, colágeno u otros compuestos químicos porque la superficie celular, el crecimiento celular y la forma de las células pueden variar. cambió.

En nuestro estudio, nos enfocamos en la etapa temprana de proliferación espontánea de dos líneas celulares de cáncer diferentes. Estas líneas celulares difieren en el tamaño de la celda, siendo las células WM155 más grandes que las células WM266-4. Por lo tanto, durante la formación de esferoides, las células WM266-4 compensan su tamaño más pequeño con una mayor tasa de proliferación para formar esferoides más grandes. Su tiempo de duplicación fue más corto que el de las células WM115, y las células WM266-4 pasaron menos tiempo en su ciclo celular que las células WM115. Estas diferencias importantes en la dinámica celular en la etapa temprana del crecimiento de esferoides se indicaron por la vida útil más corta de o-Ps para los esferoides WM266-4 en el día 4 de cultivo. En nuestro estudio anterior, comparamos el porcentaje de células viables evaluadas por el ensayo fluorescente FDA/PI (acetato de fluoresceína y yoduro de propidio) in situ, y no observamos ninguna diferencia entre la viabilidad celular en la fase temprana de formación de esferoides (en día 4) para estas dos líneas celulares de melanoma, pero se reconoció un núcleo necrótico más grande en los esferoides WM115 en comparación con WM266-4 (29,36 frente a 13,66 % de células muertas)38. Estos resultados concuerdan con los ensayos de distribución de glucosa e hipoxia, donde el núcleo del esferoide fue reconocido como la región con la concentración de glucosa más baja y las condiciones hipóxicas más altas. Se observó una disminución de la concentración de glucosa (posiblemente causada por una difusión reducida o un aumento del metabolismo anaeróbico: glucólisis) en esferoides más viejos (día 8 en cultivo) y aquellos formados a partir de más células (Fig. 6). Curiosamente, la forma irregular de WM115 permitió que la sonda fluorescente penetrara más profundamente en el núcleo, lo que se observó como un pico de intensidad de fluorescencia en la región entre 50 y 75 µm desde el centro del esferoide (Fig. 6D). Esta disponibilidad de glucosa puede facilitar el metabolismo de la glucosa anaeróbica (glucólisis) en la línea celular WM115 y puede estar relacionada con el mayor tiempo de vida medio de o-Ps en estas condiciones.

También realizamos mediciones adicionales para comparar la vida útil de o-Ps en cultivos celulares 2D y 3D. Los resultados obtenidos (Fig. 9) demuestran que el tiempo de vida del positronio es menor en el cultivo celular 3D que en el cultivo celular 2D55. Este gráfico muestra cómo la vida útil media de o-Ps es diferente entre cultivos celulares 2 y 3D, lo que se debe a su diversidad en propiedades biológicas y metabolismo. Las líneas celulares WM155 y WM266-4 se caracterizaron por la expresión de diferentes genes, por ejemplo, los responsables del transporte de aminoácidos y muchos otros que están relacionados con la formación de uniones celulares, la migración y la movilidad12,56.

Comparación de la vida útil media del positronio en cultivos celulares de melanoma en 2D y 3D. La vida útil de o-Ps en cultivo celular WM266-4 2D (cuadrado negro) según Ref.55, la vida útil de o-Ps en cultivo celular WM266-4 2D (triángulo negro) y la vida útil de o-Ps en WM266 -4 cultivos celulares en 3D (puntos negros) muestran la vida útil de o-Ps en esferoides de dos edades diferentes, 4 y 8 días después de la siembra celular.

Este estudio se realizó para evaluar la distribución de por vida de ortopositronio en esferoides de células de melanoma WM266-4 y WM115 caracterizados por diferentes grados de malignidad. Las mediciones se realizaron en dos momentos diferentes (4 y 8 días) después de la siembra. Durante este tiempo, ambas líneas de células esferoides mostraron una reducción en la vida útil de o-Ps, lo que se remonta a la proliferación celular gradual en los esferoides. Los esferoides WM266-4 más malignos mostraron una vida útil más corta de o-Ps que los esferoides de la línea celular WM115.

En resumen, los resultados muestran que el tiempo de vida de o-Ps es un parámetro útil para diferenciar entre células cancerosas con diferentes características biológicas. Cuanto mayor sea el grado de malignidad y la tasa de proliferación de células neoplásicas, menor será la vida útil del ortopositronio. Esta investigación allana el camino para el desarrollo de biomarcadores de positronio utilizando un modelo de esferoide celular.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual que contienen datos numéricos, modelos matemáticos y resultados de cálculos, incluidos gráficos de ajuste, están disponibles en el Repositorio de la Universidad Jagiellonian (RUJ) en el enlace https://ruj.uj.edu.pl/xmlui /mango/artículo/29740557.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación para la Ciencia Polaca (FNP) a través del programa TEAM POIR.04.04.00-00-4204/17, por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia a través de subvenciones no. 2019/33/B/NZ3/01004, 2021/42/A/ST2/00423 y 2021/43/B/ST2/02150, la Universidad Jagiellonian a través de los proyectos CRP/0641.221.2020, SciMat y qLife Priority Research Areas presupuesto bajo el programa Excellence Initiative—Research University, y la subvención DSC no. N17/MNS/000023 Sra. Hanieh Karimi, por su investigación de doctorado.

Departamento de Física Médica, Instituto de Física M. Smoluchowski, Facultad de Física, Astronomía e Informática Aplicada, Universidad Jagellónica, Łojasiewicza 11 Street, 30-348, Cracovia, Polonia

Hanieh Karimi y Ewa L. Stępień

Departamento de Bioquímica, Universidad de Missouri, Columbia, EE. UU.

Hanieh Karimi

Departamento de Física Experimental de Partículas y Aplicaciones, Instituto de Física M. Smoluchowski, Facultad de Física, Astronomía e Informática Aplicada, Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia

Pablo Moskal

Centro de Theranostics, Universidad Jagiellonian, Cracovia, Polonia

Paweł Moskal y Ewa L. Stepien

Facultad de Química, Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia

Ágata Zak

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HK: Metodología, investigación, redacción: borrador original, visualización, revisión y edición, PM: Conceptualización, metodología, software, análisis formal, recursos, curación de datos, redacción: borrador original, revisión y edición, visualización, supervisión, administración de proyectos, financiamiento adquisición, A.Ż.: Metodología, investigación, E.Ł.S.: Conceptualización, metodología, investigación, recursos, curación de datos, redacción—revisión y edición, supervisión, adquisición de fondos.

Correspondencia a Ewa L. Stępień.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Karimi, H., Moskal, P., Żak, A. et al. Modelo 3D de esferoide de melanoma para el desarrollo de biomarcadores de positronio. Informe científico 13, 7648 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34571-4

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Recibido: 19 junio 2022

Aceptado: 03 mayo 2023

Publicado: 11 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34571-4

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